- Gdzie zrobić badanie?
- Znaczenie kliniczne
Większość przeciwciał można wykryć techniką immunofluorescencji pośredniej z zastosowaniem różnych substratów tkankowych. Standardowym substratem do oceny przeciwciał onkoneuronalnych jest skrawek móżdżku małpy zapewniający podstawowe spektrum antygenów neuronalnych (detekcja przeciwciał anty-Hu, Yo, Ri, CV2, Ma, przeciw amfifizynie). Oprócz móżdżku stosuje się również inne tkanki zwierzęce w celu identyfikacji pozostałych przeciwciał np. nerwy rdzenne (anty-MAG, mielina), nerwy bezrdzenne (przeciwciała przeciwko niemielinowanym nerwom), trzustka (anty-GAD), hipokamp (anty-NMDAR, AMPAR rec., GABA rec. B, VGKC (LGI1, CASPR2, DPPX)), nerw wzrokowy (anty-akwaporyna 4).
Umieszczony na szkiełku podstawowym substrat zwierzęcy inkubuje się z surowicą pacjenta, a następnie dokonuje się detekcji za pomocą przeciwciał drugorzędowych sprzęgniętych z fluoroforem np. fluoresceiną (FITC). Oceny specyficznych wzorów fluorescencji dokonuje się pod mikroskopem.
Modyfikację metody immunofluorescencji pośredniej stanowi test wykorzystujący ludzkie komórki transfekowane plazmidem zawierającym cDNA odpowiedniego antygenu tzw. cell based assay. Dzięki tej metodzie możliwa jest wysoka ekspresja danego białka w komórkach, które pierwotnie go nie posiadają. Dużym ułatwieniem tej metody jest również szybka i łatwa ocena preparatów. Nie oceniamy tutaj charakterystycznego wzoru fluorescencji struktur układu nerwowego, jak w przypadku tkanek zwierzęcych, a jedynie różnicujemy reakcję pozytywną od negatywnej. Dzięki komórkom transfekowanym możliwa jest również ekspresja tych antygenów, które z powodu bardzo skomplikowanej struktury są bardzo trudne do wyprodukowania metodami inżynierii genetycznej w postaci białek rekombinowanych np. receptory powierzchniowe, kanały jonowe (jak: NMDAR, AMPAR, GABA rec. B, DNER, VGKC (LGI1, CASPR2, DPPX), akwaporyna-4). Dodatkowo ocena fluorescencji na standardowym substracie tkankowym do oceny przeciwciał przeciwko białkom powierzchniowym neuronów, jakim jest hipokamp, nie daje w tym przypadku charakterystycznego typu świecenia i nie jest możliwe różnicowanie przeciwciał.
Umieszczone na szkiełku podstawowym komórki transfekowane oraz na osobnym Biochipie komórki transfekowe pustym plazmidem (stanowiące kontrolę reakcji niespecyficznych) inkubuje się z surowicą pacjenta. Detekcji związanych przeciwciał dokonuje się za pomocą drugorzędowych przeciwciał sprzęgniętych z fluoroforem np. fluoresceiną (FITC). Ocenę szkiełka dokonuje się pod mikroskopem różnicując reakcję pozytywną od negatywnej.
Wykorzystując immunofluorescencję jako podstawową metodę oznaczania przeciwciał onkoneuronalnych należy pamiętać, że wynik ujemny nie wyklucza rozpoznania zespołu paranowotworowego. Nie każdy rodzaj przeciwciał można wykryć tą metodą. Dlatego zaleca się równoległą diagnostykę inna niezależną metodą zarówno w przypadku wyniku ujemnego jak i dodatniego (weryfikacja).
W celu wykluczenia występowania innych autoprzeciwciał mogących wpłynąć na wynik testu, zaleca się równoległą diagnostykę różnicową np. w kierunku przeciwciał przeciwjądrowych (ANA).
Metoda immunofluorescencji pośredniej pozwala na jakościową ocenę przeciwciał (wynik dodatni lub ujemny) jak również na ocenę półilościową z podaniem miana (ostatnie rozcieńczenie surowicy, na którym widoczne jest specyficzne świecenie).
Metoda ELISA (ang. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) w zależności od konstrukcji testu umożliwia oznaczanie przeciwciał lub antygenu. Dzięki kilkupunktowej kalibracji możliwe jest bardzo precyzyjne, ilościowe oznaczenie stężenia przeciwciał lub białka w jednostkach relatywnych lub międzynarodowych (o ile istnieje standardowa surowica kalibracyjna). Za pomocą testu ELISA możliwa jest ilościowa ocena przeciwciał przeciwko receptorowi acetylocholinowemu (anty-AChR) przy podejrzeniu myasthenia gravis jak również stężenia β-amyloidu 1-40, 1-42 oraz białka Tau w płynie mózgowo-rdzeniowym w diagnostyce choroby Alzheimera.
Studzienki płytki mikrotitracyjnej opłaszczone są wysokooczyszczonym rekombinowanym receptorem acetylocholinowym. Podczas inkubacji z surowicą pacjenta wiążą się do niego przeciwciała, które w kolejnym etapie wykrywane są za pomocą drugorzędowych przeciwciał sprzęgniętych z enzymem. Enzym rozkłada bezbarwny substrat do barwnego produktu. Natężenie barwy mierzone jest przez czytnik mikropłytek, a następnie przy pomocy krzywej standardowej wydawany jest wynik.
W pierwszym etapie inkubacji, kalibratory oraz próbki pacjentów rozcieńczane są roztworem zawierającym przeciwciała znakowane biotyną (np.: anty-biało tau, anty-β-amyloid 1-40 lub anty-β-amyloid 1-42) i dodawane do studzienki mikrotitracyjnej zawierającej monoklonalne przeciwciała przeciwko wybranemu antygenowi (odpowiednio anty-białko Tau, anty-β-amyloid 1-40 lub anty-β-amyloid 1-42). Powstałe kompleksy, wykrywane są za pomocą streptawidyny znakowanej enzymem. Enzym rozkłada bezbarwny substrat do barwnego produktu. Natężenie barwy mierzone jest przez czytnik mikropłytek, a następnie przy pomocy krzywej standardowej wydawany jest wynik.
Immunobloting stanowi drugą, niezależną od immunofluorescencji, półilościową metodę detekcji przeciwciał onkoneuronalnych. Jest to o tyle istotne, że zgodnie z zaleceniami Niemieckiego Towarzystwa Neurologicznego, przeciwciała onkoneuronalne powinny być oznaczane dwoma różnymi metodami jednocześnie. Gwarantuje to wysoką specyficzność i czułość oraz umożliwia dokładne określenie z jakimi przeciwciałami mamy do czynienia. Obecnie metodą immunoblot możliwa jest detekcja przeciwciał przeciwko: Hu, Yo, Ri, CV2, Ma/Ta, amfifizynie, SOX1, tytynie, Zic4, GAD65, DNER (Tr).
Oczyszczone lub rekombinowane antygeny umieszczone są na paskach membrany, którą inkubuje się z surowicą pacjenta. Detekcję związanych przeciwciał dokonuje się za pomocą drugorzędowych przeciwciał sprzęgniętych z enzymem, który rozkłada bezbarwny substrat do barwnego produktu powodując zabarwienie pasma na pasku testowym.
